光學(xué)顯微鏡中生物細胞的溫度控制面

臨的挑戰(zhàn)和解決方案

眾 所 周 zhi溫度的變化對化學(xué)反應(yīng)速率和生物機理都會產(chǎn)生影響，如何精準地控制“實驗溫度"以及研究不同溫度下的實驗樣本狀態(tài)尤為重要。因此，我們從成像樣品溫度控制面臨的常見問題出發(fā)，致力于實現(xiàn)對顯微鏡視野中的溫度進行高靈敏度的熱控制，由此獲得更嚴謹可靠且可重復(fù)的數(shù)據(jù)。

圖1：VAHEAT系列溫度控制器

一、顯微鏡中溫度控制問題：

1.液體樣品蒸發(fā) - 介質(zhì)濃度變化，在較冷表面凝結(jié)；

2.溫度漂移；

3.溫度范圍有限（最大 45–55°C），標準控制系統(tǒng)中無法實現(xiàn)快速溫度變化；

4.在較高溫度下圖像質(zhì)量下降或 TIRF 角度損失；

5.某些設(shè)置的復(fù)雜性——多個反饋回路，需要特定的溫度校準；

6.不同的溫度和整個視場的溫度梯度 - 作為散熱片的浸泡物鏡。

圖 2：a) 使用 63x/1.4 NA 油浸物鏡時的散熱效果表征。平衡至 37°C 的大型環(huán)境室不足以將樣品保持在 37°C。當(dāng)浸入式物鏡接觸樣品時，溫度至少降低 3°C，并且永遠不會回到 37°C，因為物鏡連接到顯微鏡主體，顯微鏡主體在室溫下位于腔室外部。VAHEAT 用于表征溫度下降并補償物鏡的冷卻效果。開啟 VAHEAT 后，熱沉效應(yīng)僅在qian 10 秒內(nèi)出現(xiàn)，當(dāng)溫度降至 36.2°C 時，儀器反饋回路會對其進行校正。這樣，樣品始終精確地保持在 37°C。b) 旋轉(zhuǎn)圓盤共焦裝置光學(xué)成像中心 Erlangen，數(shù)據(jù)采集地。

二、顯微鏡溫度控制的常規(guī)解決方案

圖3 傳統(tǒng)生物溫度控制設(shè)備

傳統(tǒng)的溫度控制解決方案沒有一種設(shè)備可以wan 美地適合每個對溫度敏感的實驗，往往需要根據(jù)特定的應(yīng)用為一個顯微鏡系統(tǒng)購買多個設(shè)備，然后有益地組合在一起。目前主要的解決方案有：

(1) 顯微鏡周圍的大型環(huán)境箱。缺點是溫度測量距離樣品很遠，溫度變化可能非常緩慢。

顯微鏡需要幾個小時才能達到熱平衡，緩慢的平衡也意味著與溫度相關(guān)的樣品漂移更顯著。

(2) 平臺頂部孵化器/加熱平臺插入物與客觀加熱器相結(jié)合。當(dāng)使用浸油物鏡時，這是一種有效但相當(dāng)復(fù)雜且昂貴的解決方案。

(3) 基于 Peltier 元件的設(shè)備，具有wu 與 倫 比的溫度范圍，速度快且精確，但難以小型化，并且始終需要連接到元件上的散熱片，例如更大的金屬塊，這可能是不切實際的。

(4) 基于液體流動的設(shè)備。用途廣泛且運行速度快，但不是很人性化。

(5) 另一種選擇是自己構(gòu)建溫度控制器。主要適用于商業(yè)，因為其成本高且不具有普適性。

三、使用 VAHEAT 精確控制溫度

“VAHEAT"溫度控制系統(tǒng)操作簡單，且不必擔(dān)心校準或降低圖像質(zhì)量的問題，更重要的是可精確控制視場中的實際樣品溫度，并適用于單分子和超分辨率研究等高靈敏度顯微鏡應(yīng)用設(shè)備。該裝置由四部分組成，分別是：(1)智能基底(2)顯微鏡適配器(3)探測頭(4)控制單元。核心部件是智能基底，這是一個可交換的部件，包含一個精確的四點溫度探頭和一個透明的薄膜加熱元件（如圖4所示）。使用 VAHEAT，溫度可以高達每秒 100°C 的速率變化，穩(wěn)定誤差在遠低于 0.1°C 的設(shè)定值，且無需對顯微鏡進行任何修改。VAHEAT 的核心是智能基板，功能化顯微鏡玻璃蓋玻片，其中靈敏的溫度探頭和透明加熱元件連接成一個有源反饋回路。Smart Substrates 每秒讀取和調(diào)節(jié)樣品溫度 83 次，確保它在不受環(huán)境條件影響的情況下精確地保持在設(shè)定值。Smart Substrates 還提供帶液體樣品容器的版本。該設(shè)備允許對類似于 PCR 循環(huán)儀的任意溫度曲線進行編程，并且與微流體兼容。雖然主要用于倒置配置中的高 NA 物鏡，除此之外，VAHEAT 系統(tǒng)的模塊化允許將其安裝在絕大多數(shù)光學(xué)顯微鏡上。

我們選擇了由氧化銦錫 (ITO) 制成的透明薄膜元件和直接內(nèi)置在單個芯片中的溫度探頭的加熱策略，蓋玻片，樣品安裝在其上，見圖 3，這種基于 ITO 層的加熱解決方案最有利于熱均勻性。

圖 4：a) VAHEAT 組件。該設(shè)備由智能基板 (1) 智能基底 (2)顯微鏡適配器 (3) 探測頭 (4)控制單元。b) 智能基板是功能化蓋玻片，帶有透明的納米加熱元件和直接在視野中的溫度探頭。c) 當(dāng) VAHEAT 設(shè)置為 60°C 時，智能基板的熱圖像顯示整個區(qū)域均勻加熱。

圖 5：智能基板，VAHEAT 中使用的透明加熱元件（基底可定制）

由于 VAHEAT 僅加熱少量樣品，因此它可以在高溫下與高 NA 浸油物鏡一起使用。在一項實驗中，我們使用尼康 TIRF 100x/1.49 NA 物鏡在 75.0°C 下運行 VAHEAT 六小時，物鏡在前三個小時內(nèi)由5°C 升溫至 29°C 并達到平衡，這表明 VAHEAT 可在更高的實驗溫度下使用。同時，VAHEAT 可以幫助所有生命科學(xué)家進行溫度敏感實驗，對于某些領(lǐng)域，例如嗜熱微生物的實時成像、熱響應(yīng)聚合物的表征或 DNA 納米技術(shù)，它是一項突破性技術(shù)，可以實現(xiàn)以前無法實現(xiàn)的實驗。自 2020 年推出以來，已開始使用我們的設(shè)備的 50 個實驗室和公司在各個領(lǐng)域開展工作，例如單分子生物物理學(xué)、膠體化學(xué)和細胞生物學(xué)。他們使用 VAHEAT 研究相變、液晶、脂質(zhì)層和囊泡以及人工細胞、ji 端微生物、熱休克反應(yīng)或溶液中的 DNA 和蛋白質(zhì)。引用我們設(shè)備的第一批出版物現(xiàn)已發(fā)布。VAHEAT 被 Guillaume Baffou 教授（菲涅爾研究所）的實驗室用于嗜熱細菌的活細胞成像，以研究限制對細菌生長的影響1。在 Wolfgang Zachariae 博士（生物化學(xué)領(lǐng)域的 MPI）的團隊中，在一個關(guān)于驅(qū)動減數(shù)分裂的機制的研究項目中，VAHEAT 被用于通過共聚焦顯微鏡對酵母中的溫度敏感等位基因進行熱休克和活細胞成像2。VAHEAT 還被用于在 Henrik Dietz 教授（慕尼黑工業(yè)大學(xué)）的實驗室中使用 DNA 折紙創(chuàng)建人工大分子傳輸?shù)难芯俊Ｔ撗芯渴褂脝畏肿?TIRF 成像進行檢測3。

使用即插即用的 VAHEAT 系統(tǒng)，從實驗中導(dǎo)出溫度記錄也非常簡單。因此，我們希望該設(shè)備不僅能夠?qū)崿F(xiàn)新型實驗，而且有助于改進成像實驗的報告和可重復(fù)性，從而為每個人提供高靈敏度顯微鏡。

關(guān)于Interherence：

德國Interherence公司擁有量子和生物光子學(xué)領(lǐng)域的專家團隊，為高靈敏度光學(xué)顯微鏡的發(fā)展做出很大貢獻。該團隊采用了現(xiàn)代納米制造和薄膜技術(shù)，推出了VAHEAT生物顯微溫度控制器，作為傳統(tǒng)顯微鏡的附加產(chǎn)品，shou次實現(xiàn)了在擴展溫度范圍內(nèi)的精確溫度控制，以確保生物物理光學(xué)研究可靠的測量條件。

上海昊量光電作為德國Interherence公司在中國的代理商，可為您提供專業(yè)的技術(shù)服務(wù)，若您對Interherence公司提供的VAHEAT生物顯微溫度控制器有興趣，歡迎通過郵箱、電話或微信進行溝通！

關(guān)于昊量光電：

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參考文獻:

1. Molinaro, C., et al., Are bacteria claustrophobic? The problem of micrometric spatial confinement for the culturing of micro-organisms. RSC Advances, 11, 12500–12506 (2021).

2. Mengoli, V., et al., Deprotection of centromeric cohesin at meiosis II requires APC/C activity but not kinetochore tension. The EMBO Journal, 40, e106812 (2021).

3. St?mmer, P., A synthetic tubular molecular transport system. Nature Communications, 12, 4393, (2021).